什么医院能治疗白癜风 http://www.txbyjgh.com/m/撰文
望夜
叶酸是一类基础性营养物质，既可作为辅因子参与一碳转运反应，也是体内核酸合成和氨基酸代谢的重要参与者。遗憾的是，哺乳动物无法从头合成叶酸，只能依赖胞外摄取，这就需要用到还原性叶酸转运体（RFC）。RFC同时也负责转运化疗药物，如氨甲蝶呤（methotrexate，MTX）。此外，作为阴离子交换器，RFC将叶酸和抗叶酸转入与阴离子跨膜转运相偶联，决定机体对氨甲蝶呤（抗叶酸）的敏感性，当人源hRFC发生突变或缺失时，会产生耐药性。
RFC是溶脂转运体19家族（SLC19）的成员，隶属主要协同转运蛋白（MFS）超家族。SLC19家族现有3个成员，其中SLC19A1负责阴离子交换，SLC19A2和SLC19A3是硫胺素（thiamine）的有机阳离子转运体。SLC19A1是一个双向叶酸交换器，其转运阴离子进、出细胞的米氏常数接近，叶酸的转运由有机阴离子逆向转运供能，主要指单磷酸和焦磷酸硫胺素（TMP、TPP）这类可形成高膜电势差的离子。除了对叶酸和抗叶酸显示强偏好性，SLC19A1也转运多种阴离子，包括有机类（核苷酸、硫胺素磷酸盐）和无机类（氯离子、磷酸根），它们均作为低亲和力反向底物。
尽管功能如此重要，PFC的结构仍然未知。为解决这一问题，年9月7日，杜克大学医学院的Seok-YongLee团队在Nature杂志上发表了文章MethotrexaterecognitionbythehumanreducedfolatecarrierSLC19A1，利用冷冻电镜技术解析出hRPC初始状态及结合氨甲蝶呤的复合物结构，发现决定人源还原性叶酸转运体hRFC转运活性的关键位点，并对其识别阴离子的机制提供参考。
作者首先发现，表达野生型hRFC的非洲爪蟾（Xenopuslaevis）卵母细胞中出现随时间变化的[3H]MTX（氨甲蝶呤）累积，且这种吸收受胞外有机阴离子（如cGAMP）的竞争。当hRFC抑制剂存在时，[3H]MTX的吸收被完全抑制。由于hRFC仅约60kDa且缺乏膜外刚性结构域，为进行单颗粒三维重建，作者将跨膜螺旋（TM6和TM7）间的无序区替换为脱血红素apocytochromeb的变体BRIL。经验证，在爪蟾卵中重组hRFC蛋白的表达水平和氯离子吸收水平与野生型类似，对MTX吸收的米氏常数也与野生型接近。
于是作者首先解析出包含MTX的hRFC结构hPFCEM，但结构数据中看不到对应MTX的密度。作者又解析出不含底物的初始状态hRFC结构（apohPFCEM），比较两结构的电子密度图和模型，发现基本一致。由于无法清晰判定出MTX的密度，作者更换了方法，全程使用低阴离子溶剂纯化，同时使用共价抑制剂N-羟基丁二酰亚胺接合的MTX（NHS-MTX）处理hRFC，再次解析出复合物结构，发现MTX的密度上佳，将此结构称为hRFCEM-MTX。
hRFC呈经典的MFS折叠，在上述三个结构中均为内向（inward-facing）构象（图1a）。跨膜螺旋TM1、TM4、TM7出现断裂，共同勾画出中心的MTX结合腔。TM1中有8个残基处于无序状态。中心腔体高度保守，包含两个表面电势不同的区域（图1b），靠近胞内的区域集中正电氨基酸（R42、R、R、R、K），外侧部分集中带负电氨基酸（E45、E、D）。突变体实验证实上述带电氨基酸大多有助于MTX吸收，如E、R、R和R，特别是位必须是精氨酸。
图1hRFC整体结构及其中心腔体
MTX占据中心腔，并与hRFC共价相连。MTX含三个基团：蝶啶环、对氨基苯甲酸酯（PABA）及L-谷氨酸。其中，L-Glu与TM4的R互作，R在结合底物前后发生微小的构象变化，由MTX占据中心腔导致；PABA靠近负电口袋，被Y、M、Y紧密结合；蝶啶环也朝向胞外侧，被负电口袋所结合，与TM1上的无序区段（E45、I48、T49）紧密结合。此外，E与蝶啶环形成强相互作用（~3），对底物吸收十分关键。
hRFC的一大特征是选择性吸收还原性叶酸和抗叶酸，而不倾向于结合维生素B9（叶酸）及其他阴离子化合物，它们的差异主要在于杂环的特征，前者通常为喋呤或蝶啶（如MTX），唯一的例外是吡咯并嘧啶（如培美曲塞，即PMX）。在hRFCEM-MTX结构中，部分无序的TM1通过与R42和E45形成盐桥而稳定，还与TM3上的W直接互作。TM1的构象使得I48与蝶啶环的5-8位形成直接互作。蝶啶环还与E形成紧密互作，E对MTX的识别和转运起关键作用。作者由此推测I48与E可能对hRFC的底物选择性十分重要，突变体实验验证了该猜想，底物的选择性主要由负电口袋的特征决定。
下一步作者希望分析MTX结合hRFC的动力学。利用无限制的全原子分子动力学（MD）模拟hRFC在脂质膜中的动力学，共价结合的MTX在模拟过程中状态保持稳定。而当MTX不再共价连接时，模拟过程中仅蝶啶环稳定结合于负电腔中，而L-Glu在正电腔体中高度动态，其负电谷氨酸基团被三个保守的精氨酸位点（R、R、R）所结合，称为三合精氨酸（argininetriad）。作者分析MTX中羧基与精氨酸胍基的间距变化，发现R和R距离最近，R距离较远，尤其是R虽然位于腔体的胞浆入口处，但高度动态且与γ-羧基形成互作。作者还分析L-Glu中心与精氨酸胍基的距离变化，发现其与R的距离呈正态分布，说明L-Glu的稳定主要由R负责。此外，作者还将一种抗叶酸PT对接到MTX结构中并进行MD模拟，发现PT仍稳定结合于hRFC中心腔中，由E和三合精氨酸结合，但其L-Glu由于被修饰而出现构象差异，导致PT多数时间可同时被三个精氨酸结合，这就解释为何其亲和力比MTX高10倍以上。此外，PT的结合还说明对γ-羧基的修饰可延伸hRFC宽敞的正电环，但α-羧基无此种效果，除非破坏其蝶啶环的稳定结合。当然，上面的描述仅根据PT的MD模拟推测，可能仅代表其中一种可能性。
为进一步探索hRFC结合一般阴离子的机制，作者在KCl存在而不含MTX时对hRFCEM继续进行MD模拟。氯离子密度最可能位于正电环的R与R之间，与R和T最接近，特别是R可能在将阴离子拖入腔体中发挥作用。因此，三合精氨酸在底物结合中发挥重要作用。此外，作者还通过结构模拟和比较，发现R在SLC19家族的底物选择性中起关键作用。
最后，为探索结构在药物理性设计中的潜在应用，作者比较本研究获得的带有MTX的hRFC结构与已发表的结合PMX的质子偶联叶酸转运体（PCFT）结构，发现：（1）PMX的吡咯并嘧啶被大量氢键稳定，而MTX的蝶啶环主要通过E、T49和I48、Y稳定，这种互作差异也可解释RFC可结合多种富含胺的杂环头部基团的原因；（2）PCFT结合PMX的苯环借助苯丙氨酸的π堆积力，而MTX仅通过临近芳香氨基酸的堆积结合RFC，说明底物必须达到某种尺寸才可满足不同转运体的选择性；（3）PMXL-Glu的γ-羧基是通过PCFT选择性口袋稳定的，而RFC则与MTX的α-羧基产生更紧密的互作，MD模拟显示三合精氨酸可与L-Glu灵活互作，γ-羧基被R或R灵活地适应。因此，一种叶酸转运体对底物的选择性依赖于两个谷氨酸羧基的修饰、PABA连接区长度、和/或杂环头部区特性。
综上，本文综合使用结构解析、计算模拟和功能数据分析，揭示出hRFC转运选择性的关键决定因素，同时对其阴离子的识别机制提供初步数据。通过比较两种叶酸转运体结构，对药物的理性设计提供初步信息。当然，由于现有结构有限且处于不同的底物结合构象，分析结果仍有局限性。随着后续更多此类结构的解析，对SCL19家族底物结合和转运特征的认识将更加全面深入。
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