年12月9日，美国胃肠病学会主办的国际学术期刊《细胞与分子胃肠和肝脏病学》（CellularandMolecularGastroenterologyandHepatology，IF9.）在线发表了上海交通大医院消化内科/上海市小儿消化与营养重点实验室范建高教授团队有关肠道菌群与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的又一项重要研究成果，“EscherichiafergusoniipromotesnonobesenonalcoholicfattyliverdiseasebyinterferingwithhosthepaticlipidmetabolismthroughitsownmsRNA”。
该研究首次证实弗格森埃希菌（Escherichiafergusonii）在普通饮食饲养大鼠NAFLD发生发展中发挥了重要作用，并通过体内外试验发现弗格森埃希菌的作用机制部分是通过其分泌msRNA（miRNA-sizedsmallRNAs)、抑制肝脏过氧化酶体增殖物激活受体PPARα表达等机制，诱发肝细胞脂肪变、气球样变，甚至肝脏炎症损伤和纤维化。
文中的16srRNA微生物多样性检测由欧易生物提供技术支持。
研究背景
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是与遗传易感和胰岛素抵抗密切相关的慢性代谢应激性肝病，NAFLD及其严重类型非酒精性脂肪性肝炎（NASH）现已成为全球第一大慢性肝病，与当前全球肝硬化和肝细胞癌发病及病死人数逐年增加密切相关，有效防治NAFLD特别是NASH有望减轻全球沉重的肝脏疾病负担。高达50%的NAFLD患者并不肥胖，19%的NAFLD患者体重指数在正常范围（瘦人脂肪肝），非肥胖或瘦人NAFLD与肥胖相关脂肪肝患者同样有较高比例的NASH和进展性肝纤维化；为此，需要加强非肥胖/瘦人NASH的发病机制、无创诊断及新药干预靶点的研究。
研究结果
1、埃希氏-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）与NAFLD疾病严重程度有关
为了确定NAFLD和NASH是否与肠道微生物组成的改变有关，收集健康对照(n=25)和NAFLD患者(n=29)的粪便样本进行了16SrRNA测序。PLS-DA显示，与健康对照组相比，NAFLD患者的肠道菌群组成发生了显著变化(Figure1B)。在门或属水平上的相对丰度显示了NAFLD患者肠道微生物群的改变。NAFLD组的埃希氏-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）的相对丰度值明显高于健康人群组。与健康对照组相比，非肥胖NAFLD患者埃希氏-志贺氏菌属的相对丰度显著增加(Figure1F)，表明埃希氏-志贺氏菌属可能在非肥胖NAFLD的发展中发挥致病作用。Spearman相关分析显示，埃希氏-志贺氏菌属的相对丰度与肝炎症(AdjR2=0.,P0.)和纤维化(AdjR2=0.,P0.)的发生有关(Figure1G)。
图1Escherichia-Shigella与NAFLD患者的疾病严重程度相关
2、Escherichiafergusonii改变了大鼠肠道微生物组
在大肠杆菌属中已鉴定出7种，其中Escherichiafergusonii是一种罕见的可同时感染人和动物的病原菌。采用fergusonii口服灌胃大鼠来研究其对大鼠肠道微生物组和生物学功能的影响。在门水平上，Escherichiafergusonii处理增加了Proteobacteria的相对丰度，降低了Bacteroidetes的相对丰度(Figure2D)。LEfSe分析确定了一些最有可能解释组间差异的菌群(Figure2E)。PICRUSt功能分析表明，与脂质合成和代谢相关的通路也被Escherichiafergusonii所调控(Figure2F)。这些数据表明，Escherichiafergusonii通过改变肠道微生物群的分布来扰乱宿主代谢稳态，从而介导NAFLD进展。
图2Escherichia-Shigella改变了大鼠肠道微生物组
3、Escherichiafergusonii调节宿主脂质代谢
为了了解肝脏脂质积累升高的机制，测量了脂肪酸和胆固醇代谢密切相关的生化指标。与生理盐水对照组相比，HFHC中甘油三酯、胆固醇、空腹血糖、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、同型半胱氨酸、总胆汁酸水平显著升高，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平下降。相比之下，Escherichiafergusonii提高了血清甘油三酯、胆固醇、空腹血糖、LDL-C、同型半胱氨酸和总胆汁酸水平，降低了HDL-C水平(Figure3A-G)。同时评估了与脂质代谢相关的基因表达，Escherichiafergusonii增加了与脂肪再生相关的基因的表达，如Srebp1c、Scd、Fasn和Acc。与脂肪酸氧化(Cpt1a,Fabp1,Acadl,Acadvl)和脂质转运(Acsl1和Fatp2)相关的基因在Escherichiafergusonii处理或HFHC饮食中也被下调(Figure3I)。这些数据表明，Escherichiafergusonii通过抑制脂肪酸氧化和提高脂质来扰乱宿主的肝脏脂质代谢。
图3Escherichia-Shigella调节宿主脂质代谢
4、Escherichiafergusonii的msRNA测序分析
为了了解Escherichiafergusonii引起的肝脏脂质积累的机制，接下来对Escherichiafergusonii的产物进行测序。为了确定Escherichiafergusonii的msRNA谱，并研究其是否影响宿主的脂质代谢，对其进行了msRNA测序分析。在所有被鉴定的msRNA中，msRNA和msRNA的克隆拷贝数最高。生物学过程表明，Escherichiafergusonii的msRNA对宿主的肝脏代谢过程有明显的影响，包括脂质代谢(Figure4B)。通过qPCR验证了msRNA的表达水平，处理后msRNA的表达量最高且上调幅度最大。
图4Escherichia-ShigellamsRNA测序及qPCR定量结果
5、Escherichiafergusonii的msRNA通过调节PPARα促进脂质积累
为了检测msRNA表达的增加是否参与了宿主脂质代谢的调节，采用miRanda软件进行靶基因预测。其中PPARα被预测为msRNA的靶基因之一。通过用msRNAmimic转染Huh7和HepG2细胞，来评估msRNA对PPARα水平的影响。转染msRNAmimic后，msRNA的表达水平显著升高；虽然PparamRNA水平无变化，但蛋白水平显著降低(Figure5B-C)。
图5Escherichiafergusonii的msRNA通过调节PPARα促进脂质积累
研究结论
NAFLD患者粪便中大肠埃氏菌属-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)的丰度显著高于健康对照人群，且与NAFLD患者肝脂肪变、炎症损伤及纤维化程度密切相关，非肥胖的NAFLD患者粪便中大肠埃氏菌属-志贺氏菌属的丰度与肥胖的NAFLD患者之间无显著差异，两组都显著高于健康对照人群，提示肠道中大肠埃氏菌属-志贺氏菌属独立于肥胖参与NAFLD的发病。为了探究弗格森埃希菌诱导非肥胖NASH的机制，课题组通过对弗格森埃希菌（Escherichiafergusonii）进行msRNA（miRNA-sizedsmallRNAs)测序发现，长期灌胃弗格森埃希菌的大鼠尽管体重与对照大鼠相似，但其肝脏弗格森埃希菌来源的msRNA水平显著升高。进一步通过体内外试验证实，msRNA通过抑制肝脏PPARα等脂代谢相关基因的表达，导致肝脏脂代谢紊乱，从而诱发肝细胞脂肪变性和脂毒性。
文章链接：DOI:10./j.jcmgh..12.
本文的第一作者是上海交通大医院内科基地住院规培医师信丰智博士，共同通讯作者为上海市儿科医学研究医院消化内科范建高教授。本研究得到了国家科技部精准诊疗课题、国家自然科学基金面上项目以及上海市领军人才计划的资助，得到了上海市儿科医学研究所所长/上海市小儿消化与营养重点实验室主任蔡威教授的大力支持和无私帮助，以及张炜真教授、赵力平教授等的指导。
博士后招生
上海交通大医院消化内科主任/上海市小儿消化营养重点实验室课题组长范建高教授，主攻代谢性肝病（非酒精性脂肪性肝病和肝豆状核变性）的防治。目前承担上海市领军人才计划优秀跟踪项目、国家科技部重点研发计划重点专项课题以及2项国家自然科学基金面上项目。年计划招收1-2名博士后，欢迎感兴趣者联系。
参考文献
范建高团队近年来发表的重要SCI论文
[1]XinFZ,ZhaoZH,LiuXL,PanQ,WangZ,ZengL,ZhangQR,YeL,WangW,ZhangRN,GongZZ,HuangLJ,SunC,JiangL*,FanJG*.EscherichiafergusoniipromotesnonobesenonalcoholicfattyliverdiseasebyinterferingwithhosthepaticlipidmetabolismthroughitsownmsRNA.CellMolGastroenterolHepatol.Dec9,
